Skip to content

Wirus Epsteina-Barra i komórkowa ścieżka sygnałowa w chłoniakach od pacjentów z niedoborem odporności cd

1 miesiąc ago

500 words

Przeciwciała monoklonalne anty-LMP1 CS1, CS2, CS3 i CS4 pochodziły z Dako (Carpinteria, CA). Surowicę do cząsteczek TRAF uzyskano z Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA). Królicze przeciwciała anty-TRAF1 (N19) zastosowano do barwienia immunofluorescencyjnego i immunoprecypitacji, a króliczą anty-TRAF1 surowicę odpornościową (S19) zastosowano do immunoblottingu zachodniego. Królicze antyserum anty-TRAF2 (C20 i N19) zastosowano do barwienia immunofluorescencyjnego i immunoblotingu zachodniego. Antiserum N19 anti-TRAF1 i N19 anti-TRAF2 mają wyraźną specyficzność i nie reagują krzyżowo. Królicze przeciwciało anty-TRAF3 H20 zastosowano do barwienia immunofluorescencyjnego, immunoprecypitacji i immunoblotingu zachodniego. Normalną surowicę kozią i króliczą zakupiono od Sigma Chemical (St. Louis). Przeciwciało przeciw kozim antidium (H i L) lub kozie przeciwbłędne wtórne przeciwciała sprzężone z zielem Oregonu 488 i czerwienią czerwoną Texas otrzymano z Molecular Probes (Eugene, Oreg.). Western Immunoblotting
Białka solubilizowano ze świeżej lub zamrożonej tkanki w buforze do próbek (62,5 mM chlorowodorek TRIS, pH 6,8, 2 procent dodecylosiarczanu sodu, 10 procent glicerolu i 5 procent 2-merkaptoetanolu) w 95 ° C przez 10 minut. Lizaty usuwano przez mikrowirowanie przez pięć minut, a supernatanty zbierano w celu rozdzielenia metodą nieciągłej elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem-poliakrylamidem zgodnie ze standardowymi procedurami. Po rozdzieleniu białka przenoszono na nitrocelulozę i membrany badano biotyną. skoniugowane przeciwciało monoklonalne anty-LMP1 (S12), przemyto, a następnie sondowano znakowaną 125I streptawidyną (Amersham, Arlington Heights, IL). Po ostatnim przemyciu reaktywne prążki białek wykrywano przez autoradiografię za pomocą folii Kodak XAR-5 (Eastman Kodak, Rochester, NY).
Mikroskopia immunofluorescencyjna
Skrawki utrwalono w metanolu-acetonie (3: obj./obj.) W -20 ° C przez 5 do 10 minut. Po utrwaleniu, preparaty krótko przemywano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem, a następnie blokowano 10% (obj./obj.) Normalnej surowicy koziej przez 20 minut i barwiono przeciwciałami monoklonalnymi dla LMP1 i surowicy odpornościowej królika dla TRAF1, TRAF2 lub TRAF3 w następujący sposób. Wszystkie rozcieńczenia przeciwciał były w 10% normalnej surowicy koziej w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Skrawki tkanki inkubowano przez godzinę z supernatantem hybrydom S12 (anty-LMP) (rozcieńczenie, 1: 100) i jedną z następujących: 400 ng N19 (anty-TRAF1) na mililitr, 400 ng H20 (anty-TRAF3). ) na mililitr, 400 ng C20 (anty-TRAF2) na mililitr lub 400 ng N19 (anty-TRAF2) na mililitr. Próbki następnie przemyto trzy razy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem przez 10 minut. Przeciwciała wtórne zielonkawa koziego antygenu 488 IgG (H i L) i koziego antylopybitego IgG (H i L) z kozła Texas X X były inkubowane w stężeniu 2 .g na mililitr, z odcinkami przez 30 minut, a następnie trzema 10-minutowymi przemyciami w sól fizjologiczna buforowana fosforanem. Poplamione skrawki suszono na powietrzu, montowano w ProLong Antifade (Molecular Probes) zgodnie z instrukcjami producenta i fotografowano pod mikroskopem (model ES800, Nikon, New York) wyposażonym w epifluorescencyjny system do wykrywania izotiocyjanianu fluoresceiny, Texas Red, lub połączenie tych dwóch.
Test przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej
Wyciągi jądrowe zostały przygotowane z hodowanych komórek lub tkanek, jak opisano wcześniej.16 Zawartość białka określono za pomocą testu Bradforda (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
[podobne: polyporus, dekstran, suprasorb ]
[podobne: zakrzepica leczenie, zakrzepica nóg, olx kościan ]

0 thoughts on “Wirus Epsteina-Barra i komórkowa ścieżka sygnałowa w chłoniakach od pacjentów z niedoborem odporności cd”