Skip to content

owłosienie sutków

3 miesiące ago

614 words

Następnie surowicę rozcieńczono seryjnie w PBS, powleczono na 96-mikrostudzienkowej płytce i inkubowano w 4 ° C przez noc. Studzienki następnie blokowano PBS zawierającym 20% FBS. Po przemyciu PBS zawierającym 0,05% Tween-20, płytkę inkubowano z rozcieńczeniem 1: 1000 króliczego anty-CRT Ab (StressGen Biotechnologies Corp.) przez 2 godziny w 37 ° C. Płytkę dalej inkubowano z rozcieńczeniem 1: 1000 sprzężonego z peroksydazą osiołowego przeciwciała anty-króliczego IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA) w temperaturze pokojowej przez godzinę. Płytkę przemyto, opracowano za pomocą 1-etapowego Turbo TMB-ELISA (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA) i zatrzymano za pomocą M H2SO4. Stężenie CRT lub białka CRT / E7 określono przez porównanie z krzywą standardową oczyszczonego rekombinowanego białka CRT z bakterii. Test cytotoksycznego limfocytu T przy użyciu transfekowanych komórek 293Db, Kb jako komórek docelowych. Oznaczenia cytotoksycznych limfocytów T (CTL) przeprowadzono przez ilościowe pomiary dehydrogenazy mleczanowej (LDH) przy użyciu nie-radioaktywnych zestawów do oznaczania cytotoksyczności CytoTox96 (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) zgodnie z protokołem producenta. Jako komórkę docelową zastosowano różne transfekowane DNA komórki 293Db, Kb, podczas gdy jako komórki efektorowe zastosowano linię komórek T CD8 + ograniczoną Db E7 (21). Nie-transfekowane komórki 293Db, Kb zastosowano jako kontrolę negatywną. Komórki 293 Db, Kb zebrano 40. 44 godziny po transfekcji. Testy CTL przeprowadzono z komórkami efektorowymi i komórkami docelowymi (104 na studzienkę) zmieszanymi razem w różnych stosunkach efektor / cel (E / T), 1: 1, 3: 1, 9: i 27: 1, w końcowej objętości. 200 l. Po 5-godzinnej inkubacji w 37 ° C zebrano 50. L hodowanych pożywek w celu oceny ilości LDH w hodowanych pożywkach. Procent lizy obliczono z następującego równania: 100 x (A (B) / (C (D)), gdzie A jest odczytem doświadczalnej efektorowej wartości sygnału, B jest spontaniczną wartością sygnału tła efektora, C jest maksymalnym sygnałem wartość z komórek docelowych, D jest docelową spontaniczną wartością sygnału tła. Test CTL z zastosowaniem komórek dendrytycznych poddanych pulsacji lizatami transfekowanych komórek 293Db, Kb jako komórek docelowych. Testy CTL przeprowadzono stosując świeżo wyizolowane komórki dendrytyczne (DC) pulsowane lizatami komórkowymi jako komórkami docelowymi i limfocytami T CD8 + specyficznymi dla E7 ograniczonymi do Db jako komórki efektorowe z zastosowaniem protokołu podobnego do opisanego poprzednio (15). Stężenie białka w lizatach określano za pomocą testu białka BioRad (BioRad Laboratories Inc.) zgodnie z protokołem dostawcy, a ilość białka E7 sprawdzono przy użyciu standardowego testu ELISA (20). Lizaty komórkowe z komórek 293 Db transfekowanych DNA E7 lub CRT / E7 standaryzowano pod względem stężenia białka E7. DC wytworzono przez pulsowanie różnymi stężeniami lizatów komórkowych różnych transfekowanych DNA komórek 293Db, Kb (50 .g / ml, 10 .g / ml, 2 .g / ml i 0,4 .g / ml) w końcowym teście. objętość 2 ml przez 16-20 godzin. Testy CTL przeprowadzono przy ustalonym stosunku E / T wynoszącym 9: przy użyciu 9 × 104 komórek E7 specyficznych mieszanych z x 104 przygotowanych DC w końcowej objętości 200 .l. Cytolizę określono przez ilościowe pomiary LDH, jak opisano wcześniej. Doświadczenia z ochroną przeciwnowotworową in vivo. Do eksperymentu ochrony nowotworu myszy C57BL / 6 (pięć na grupę) nie otrzymały żadnego szczepienia lub były immunizowane 2 .g / mysz plazmidu bez wstawki, CRT, E7, CRT / E7 lub CRT zmieszanego z E7 (CRT + E7 ) DNA z działkiem genowym. Tydzień później myszy były stymulowane tym samym schematem, co pierwsze szczepienie. Tydzień po ostatnim szczepieniu myszy podskórnie poddano prowokacji 5 x 104 komórek TC / w prawą nogę. Myszy monitorowano pod kątem wzrostu nowotworu przez badanie dotykowe i inspekcję dwa razy w tygodniu, aż do momentu ich uśmiercenia w dniu 60. Eksperymenty zubożenia w warunkach in vivo
[więcej w: zakrzepica nóg, zapalenie ucha u dziecka objawy, ziarnica złośliwa i chłoniaki nieziarnicze ]

0 thoughts on “owłosienie sutków”