Skip to content

enteropathogenic e coli

2 miesiące ago

537 words

Zbadaliśmy nowe zastosowanie CRT chimerycznie połączonego z antygenem modelowym (E7 HPV-16) do leczenia nowotworów poprzez połączenie immunoterapii swoistej antygenowo i antyangiogenezie. Metody Konstrukty i przygotowanie plazmidowego DNA. Generowanie pcDNA3-E7, białka fluorescencyjnego pcDNA3 (pcDNA3-GFP) i pcDNA3-E7 / GFP opisano wcześniej (13). W celu wytworzenia pcDNA3-CRT, CRT najpierw amplifikowano za pomocą PCR stosując królicze cDNA CRT jako matrycę (14) i zestaw starterów, 5a-CCGGTCTAGAATGCTGCTCCCTGTGCCGCT-3. i 5. -CCGGGAATTCCAGCTCGTCCTTGGCCTGGC-3 .. Istnieje ponad 90% homologii pomiędzy CRT królika, człowieka, myszy i szczura (14). Zamplifikowany produkt sklonowano następnie w miejscach Xbal / EcoRI wektora pcDNA3 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, USA). W celu wytworzenia pcDNA3-CRT / E7, E7 najpierw amplifikowano za pomocą zestawu starterów 5. -Ggggaattcatggagatacaccta-3. i 5. -ggtggatccttgagaacagatgg-3. i klonowano do miejsc EcoRI / BamHI pcDNA3-CRT w celu wytworzenia pcDNA3-CRT / E7. W celu wytworzenia pcDNA3-CRT / E7 / GFP fragment DNA CRT wyizolowano z pcDNA3-CRT i sklonowano w miejscach XbaI / EcoRI pcDNA3-E7 / GFP. Plazmidowe konstrukty potwierdzono przez sekwencjonowanie DNA. Transfekcja komórek 293Db, Kb i konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. DNA E7 / GFP lub CRT / E7 / GFP DNA transfekowano do komórek 293 Db, Kb, barwiono mysim mAb przeciw kalneksynom (StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, Kolumbia Brytyjska, Kanada), a następnie skoniugowano z Cy3 F (ab) 2 fragment koziego przeciwciała przeciwko mysim IgG (Jackson ImmunoReseach Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA) i badano pod konfokalnym skaningowym mikroskopem laserowym z zastosowaniem protokołu opisanego poprzednio (15). Szczepienie DNA. Przygotowanie cząstek złota powlekanych DNA i szczepienia DNA za pośrednictwem cząsteczek genowych przeprowadzono za pomocą pistoletu genowego sterowanego helem (BioRad Laboratories Inc., Hercules, California, USA) zgodnie z wcześniej opisanym protokołem (16). Kontrolne plazmidowe, E7, CRT lub CRT / E7 powleczone DNA cząsteczki złota dostarczono do ogolonego brzusznego regionu myszy przy użyciu pistoletu genowego sterowanego helem (BioRad Laboratories Inc.) o ciśnieniu wylotowym 400 psi. Wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin i cytometria przepływowa. Myszy immunizowano 2 .g różnych szczepionek DNA i otrzymywano dawkę przypominającą z tym samym schematem tydzień później. Splenocyty zebrano tydzień po ostatnim szczepieniu. Przed wybarwianiem wewnątrzkomórkowej cytokiny, 3,5 x 105 splenocytów połączonych z każdej grupy szczepionej inkubowano przez 16 godzin z (ig / ml peptydu E7 (aa 49-57) zawierającym epitop MHC klasy I (17) do wykrywania specyficznego względem E7 CD8 + Prekursory komórek T lub 10 .g / ml peptydu E7 (aa 30-67) zawierające epitop MHC klasy II (18) do wykrywania prekursorów komórek T CD4 + specyficznych względem E7. Barwienie markerem powierzchniowym CD8 lub CD4 i wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin dla IFN-y i IL-4, jak również analizę metodą cytometrii przepływowej, przeprowadzono w warunkach opisanych wcześniej (16). ELISA. Obecność przeciwciał anty-HPV 16 E7 w surowicy charakteryzowała się bezpośrednim testem ELISA, jak opisano wcześniej (19). Myszy immunizowano 2 .g różnych szczepionek DNA i otrzymywano dawkę przypominającą z tym samym schematem tydzień później. Surowice przygotowano z myszy w 14 dniu po immunizacji. Płytkę ELISA odczytano standardowym czytnikiem ELISA przy 450 nm. W celu wykrycia stężenia białka CRT lub CRT / E7 w surowicy szczepionych myszy, przeprowadziliśmy pośredni test ELISA, stosując protokół podobny do opisanego poprzednio (20). Pokrótce, myszy immunizowano 16 .g DNA CRT lub CRT / E7 i otrzymywano dawkę przypominającą z tym samym schematem tydzień później. Surowice zebrano 3, 7, 11, 14 i 18 dni po ostatniej immunizacji
[podobne: zakrzepica leczenie, zapalenie przyzębia, zespół fallota ]

0 thoughts on “enteropathogenic e coli”

  1. może ktoś wie, jak szybko (w dniach) można i należy podjąc rehabilitację u chorego z nadciśnieniem