Skip to content

andrzej jędrzejczyk warszawa lekarz

3 miesiące ago

557 words

Myszy poddano eutanazji 16 dnia. Wtyczki Matrigel wycięto z otaczających tkanek łącznych. Połowę czopów Matrigel utrwalono w 10% formaldehydzie, zatopiono w parafinie, podzielono i zabarwiono hematoksyliną i eozyną lub barwnikami Giemsy, aby obliczyć gęstość naczyń krwionośnych. W każdej sekcji wybrano pięć najbardziej naczyniowych obszarów. Liczba mikropłytek została uzyskana przy x 400, a średnia liczba w pięciu polach dla korków Matrigela została obliczona i określona jako liczba MVD. Pozostałą połowę czopów Matrigel badano na zawartość hemoglobiny zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw odczynników Drabkin, Sigma Diagnostics Co., St. Louis, Missouri, USA). Wyniki Badanie mikroskopowe z użyciem fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego ujawnia, że połączenie CRT z E7 skierowane jest na antygen do ER. Scharakteryzowaliśmy ekspresję E7 w lizatach i supernatancie z komórek transfekowanych dzikim typem E7 lub CRT / E7 DNA za pomocą analizy Western blot (dane nie pokazane). Analiza supernatantów z hodowli komórkowych ujawniła, że białko było wydzielane z komórek transfekowanych DNA CRT / E7, ale nie z komórek transfekowanych E7. Wcześniejsze badania wykazały, że CRT może wspomagać prezentację antygenu poprzez wiązanie z peptydami dostarczonymi do ER przez TAP-1 i TAP-2 (8) oraz z MHC klasy I-a2m (9). Aby ustalić, czy powiązanie z CRT wpływa na subkomórkową lokalizację E7, połączyliśmy gen GFP z 3. koniec genu E7 lub chimerycznego genu CRT / E7 w wektorze pcDNA3. Transfekcja i późniejsze badanie za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego ujawniło, że komórki transfekowane DNA E7 / GFP wykazywały homogenną dystrybucję cytoplazmatyczną / jądrową (Figura 1b), podczas gdy komórki transfekowane konstruktem DNA CRT / E7 / GFP wykazywały wzorzec sieci zgodny z lokalizacją ER ( Figura 1e). Aby potwierdzić, że chimera CRT / E7 / GFP została faktycznie rozdzielona na ER, przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne komórek transfekowanych E7 / GFP lub CRT / E7 / GFP przy użyciu Ab przeciwko kalneksynie (Figura 1, a i d) , dobrze scharakteryzowany marker ER. Jak pokazano na rys. 1, c i f, obserwowano kolokalizację z białkiem kumeksynowym w komórkach transfekowanych CRT / E7 / GFP, ale nie w komórkach transfekowanych E7 / GFP, co wskazuje, że fuzja CRT z E7 / GFP ułatwiła wejście białko do ER. Figura Ogniskowa mikroskopia fluorescencyjna dla wykazania ekspresji i dystrybucji białek E7 i chimerycznych CRT / E7. Komórki 293Db, Kb transfekowano pcDNA3-E7 / GFP (a. C) lub DNA pcDNA3-CRT / E7 / GFP (d. F). Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono jak opisano w Methods. W celu wykrycia białka GFP odnotowano zieloną fluorescencję (b i e). W celu wykrycia endogennego białka kalneksiny zaobserwowano czerwoną fluorescencję (aib). Kontrole pomijające pierwszorzędowe Ab nie wykazały specyficznej czerwonej fluorescencji (dane nie pokazane). Kolokalizację GFP i kalneksyny wykazano żółtym kolorem na połączonym obrazie (c i f). Szczepienie DNA CRT / E7 w znacznym stopniu wzmacnia odpowiedzi immunologiczne zależne od E7 CD8 + T i odpowiedzi Ab specyficzne względem E7. Aby określić, czy DNA CRT / E7 może wzmacniać odpowiedzi immunologiczne zależne od E7 komórek T u myszy, przeprowadziliśmy wewnątrzkomórkowe barwienie cytokin z analizą cytometrii przepływowej, aby scharakteryzować prekursory komórek T CD8 + i CD4 + specyficzne względem E7. Jak pokazano na Figurze 2a, szczepienie DNA CRT / E7 generowało najwyższą częstotliwość specyficznego dla E7 IFN-y wydzielającego prekursory komórek T CD8 + (204 / 3,5 x 105 splenocytów) w porównaniu z myszami zaszczepionymi DNA E7 (18 / 3,5 x 105). splenocyty) (P <0,01). W przeciwieństwie do tego DNA kodujący E7 połączony z nieistotnym białkiem, takim jak GFP, nie wykazywał specyficznego wzmocnienia prekursorów komórek T CD8 + swoistych dla E7 (dane nie pokazane). [hasła pokrewne: ziarnica zlosliwa, hiperamonemia, zespół mielodysplastyczny ]

0 thoughts on “andrzej jędrzejczyk warszawa lekarz”